Il test viene effettuato su un campione di sangue di soggetti
preferibilmente a digiuno. Il prelievo venoso deve essere di circa 4,5-5 cc.
I campioni fortemente lipemici od emolizzati devono essere scartati. Nei
soggetti sottoposti a terapia cortisonica o antistaminica, si consiglia di
sospendere tale trattamento almeno 5 giorni prima dell'esecuzione del
prelievo.
Il campione deve essere messo in una provetta contenente lo 0,5 ml di Sodio
Citrato al 3,8% (4,5 cc di sangue+0,5 ml citrato).
E' preferibile eseguire il
test in giornata ed in ogni caso deve essere eseguito entro un massimo di
48/72 ore dal prelievo se il campione è conservato correttamente in
frigorifero a 8°C. Non usare campioni congelati. I campioni possono essere
lasciati sedimentare per qualche ora, oppure centrifugati a bassa velocità (1600) per alcuni minuti, per ottenere la separazione tra plasma e siero. A
questo punto si miscela in una provetta una certa aliquota di acqua
distillata, plasma e pappa leucocitaria (il sottile strato opaco che divide
plasma e siero) e si procede all’allestimento dei vetrini costituiti da tre
pozzetti in cui è posizionato l’estratto secco di ogni alimento da testare.
Dopo aver posizionato una precisa aliquota della miscela su ciascun pozzetto,
si procede alla lettura dei vetrini (dopo un tempo di incubazione di circa
15 minuti). Il biologo responsabile della lettura osserverà la reazione dei
leucociti posti a contatto con l’estratto dell’alimento e la classificherà in
base alla seguente scala di lettura: Negativo, grado I (rigonfiamento dei
leucociti), grado II (modificazione e vacuolizzazione delle cellule), grado
III (rottura della membrana e disgregazione cellulare).
Avvertenze e precauzioni per l’esecuzione del test
Per ottenere risultati corretti e riproducibili, é necessario osservare le seguenti norme:
- Non usare i reagenti dopo la data di scadenza.
- Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile usare una pipetta per ogni campione.
- Rispettare i tempi di incubazione.
- Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, é necessario osservare le seguenti norme di sicurezza:
- Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e durante il dosaggio.
- Non pipettare i reagenti con la bocca.
- Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio.
Tutti i campioni di
origine umana devono essere considerati potenzialmente infettivi; pertanto
i rifiuti del dosaggio devono essere decontaminati ed eliminati secondo
opportune regole di sicurezza.
Evitare la produzione
di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si verificasse ripulire
accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il
mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente
infetto ed eliminato secondo le modalità opportune.
I reagenti per cui non
si fornisce la scheda di sicurezza non contengono sostanze chimiche pericolose
o se presenti, queste sono al di sotto dei limiti di concentrazione definiti
nel D.Lgs.285/98 e nella direttiva CEE 91/55.
Ai sensi del D.L. italiano
n. 22 del 05.02.97, che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE,
91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali
sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione
CER 180103; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate
al ritiro ed allo smaltimento.
La scelta dei materiali di fabbricazione
Quanto ai vetrini si è tenuto conto, in prima istanza, della qualità del vetro in termini di trasparenza, caratteristiche superficiali, regolarità di taglio e assenza di imperfezioni. Successivamente si è cercato un materiale che potesse isolare i campi di lettura senza in alcun modo interferire con gli elementi interessati alla reazione. Per questa ragione si è scelta la maschera in teflon che oltre a garantire ottima tenuta fra i pozzetti, non ha cessioni nei confronti dei materiali a contatto. La superficie del vetro in contatto con la reazione non è trattata in alcun modo.
La confezione in PET monouso, materiale totalmente riciclabile con cessioni trascurabili per i liquidi a contatto diretto - quindi inesistenti per gli allergeni essiccati - è studiata per garantire la massima protezione dagli agenti esterni e quindi è sigillata in busta termosaldata. Il prelievo dei vetrini per la successiva disposizione sul vassoio risulta facilitata per l’operatore.
Il confezionamento avviene in clean room dove l’operatore lavora protetto da indumenti sterili monouso e l’aria è trattata, per garantire l’assenza di inquinanti aerotrasportati che potrebbero contaminare gli allergeni nella fase di dispensazione sul vetrino.
I cibi, gli additivi alimentari compresi, possono provocare reazioni avverse, che possono essere distinte in tossiche, cioè dipendenti dalla dose assunta e dalla sensibilità del soggetto e in non tossiche, presenti solo in individui sensibili e non strettamente dose dipendenti. Le reazioni non tossiche agli alimenti, quando immunologicamente mediate, si definiscono allergie alimentari, mentre il termine intolleranza alimentare va utilizzato per le reazioni verso alimenti non necessariamente mediate immunologicamente.
Il sistema immunitario composto da agenti umorali (anticorpi) e agenti cellulari (leucociti) è deputato al riconoscimento di ogni sostanza che entra nell'organismo umano, come anche il cibo che percorrendo il canale digerente entra in contatto con il sistema immunitario.
Gli alimenti ingeriti possono causare in alcuni soggetti modificazioni della serie leucocitaria più o meno evidenti, fino ad arrivare in alcuni casi alla distruzione dei leucociti circolanti, denominata reazione citotossica con alterazioni sia morfologiche, sia funzionali dei leucociti.
Sintomatologie di diversa natura, quali malesseri diffusi con mal di testa, dolori muscolari, problemi digestivi, irritazioni cutanee possono essere causate da intolleranze alimentari da individuare ai fini di prevenire l'istaurarsi di situazioni patologiche croniche.
La possibilità di effettuare indagini diagnostiche atte a rilevare l'eventualità di intolleranze alimentari nei confronti di determinati alimenti, permette di attuare un programma dietetico mirato a rimuovere le problematiche e quindi, a migliorare lo stato psico-fisico del paziente.
L’individuazione delle sostanze alimentari scatenanti fenomeni e disturbi, comportano immediatamente l’allontanamento dalla dieta delle stesse con effetti evidenti di miglioramento fino alla scomparsa della sintomatologia.
L’allontanamento dei cibi è solo temporanea, in quanto il regime dietetico prevede, dopo un certo tempo, un lento, graduale e controllato reintegro dell’alimento.
La manifestazione di intolleranza alimentare è sempre più diffusa nei paesi di culture ed economia occidentale.
Il kit è basato sul metodo di valutazione ottica del danno cellulare ai leucociti, quando un campione di sangue di un soggetto entra in contatto diretto con sostanze alimentari specifiche.
Il metodo non è in grado
di mettere in evidenza fenomeni di allergia alimentare, la quale è sinonimo
di meccanismo immunologico IgE mediato, mentre il termine intolleranza
alimentare è sinonimo di reazioni idiosincrasiche, tossiche, metaboliche.
Le allergie alimentari danno un’immediata reazione rispetto all’assunzione
dell’alimento scatenante, mentre le reazioni date da problemi di intolleranza
possono manifestarsi lontano qualche giorno, dall’assunzione dell’alimento.
Attenzione il presente sistema diagnostico non deve essere utilizzato in sostituzione dei metodi diagnostici per la determinazione delle IgE totali e specifiche circolanti nel siero umano, ma altresì come metodo integrativo ai fini di meglio individuare le problematiche alimentari del soggetto.
MATERIALI E METODI - PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Il dosaggio può essere effettuato su sangue, preferibilmente di soggetti a digiuno, di un prelievo venoso di circa 4,5-5 cc. I campioni fortemente lipemici od emolizzati devono essere scartati. Nei soggetti sottoposti a terapia cortisonica o antistaminica, si consiglia di sospendere tale trattamento almeno 5 giorni prima dell'esecuzione del prelievo.
Il campione deve essere messo inuna provetta contenente
lo 0,5 ml di Sodio Citrato al 3,8% (4,5 cc di sangue+0,5 ml citrato).
E' preferibile eseguire il test in giornata ed in ogni caso deve essere
eseguito entro un massimo di 48/72 ore dal prelievo se il campione è conservato
correttamente in frigorifero a 8°C.
Non usare campioni congelati. I campioni non vengono centrifugati ma semplicemente sedimentati over night. Se si desidera una maggior concentrazione del campione da testare si può centrifugare la provetta a bassa velocità (1600) per alcuni minuti.
Con una pipetta a volume variabile (puntali da 200 µl, o Pasteur monouso si prelevano 300 µl di fisiologica sterile+300 µl di plasma. Si mettono in una microprovetta (capienza almeno 2 ml).
Si prelevano successivamente 400 µl di pappa leucocitaria (al limite
di separazione tra plasma e parte corpuscolata-cover coat). I volumi
indicati sono sufficienti per effettuare il test da 60 alimenti.
Se si
procede per quello da 90 alimenti i volumi da preparare sono per la fisiologica
400 µl, per il plasma 400 µl e per la pappa leucocitaria 600 µl.
Procedimento operativo
Una volta aggiunta la parte corpuscolata si omogeneizza
con molta delicatezza. Utilizzando una pipetta a volume fisso (range
1-20 ml) si addizionano 5/6 ml di campione al centro di ogni cerchio
a contatto con gli estratti alimentari predisposti sui singoli vetrini.
Per ottenere il miglior risultato è conveniente mettere precisamente il preparato sull'estratto alimentare per far si che questo si ricostituisca e quindi si misceli in modo appropriato con il campione da esaminare. Si preparano 3/4 vetrini per volta e si collocano i vetrini coprioggetto 18x18 ovvero 24x60 su ogni portaoggetto.
Il vetrino va adagiato lentamente senza fare nessuna pressione. Se si nota una non omogeneità (copertura totale del cerchio) a volte causato dalla diversa composizione dell'estratto alimentare o della non completa omogeneizzazione del campione di sangue + estratto è possibile fare una leggera pressione sul vetrino con un puntale affinché il sangue copra completamente il cerchio.
Una volta preparati i vetrini con gli estratti alimentari + i vetrini di controllo negativo – che permettono di valutare lo stato generale dei globuli bianchi del singolo paziente in assenza di reazione imputabile all'estratto alimentare - si attendono 15-20 minuti prima della lettura. L'incubazione non deve superare 1 ora.
Le modificazioni strutturali dei leucociti possono essere valutate con la lettura microscopica del vetrino trattato, avendo presente la seguente tabella indicativa.
| Nessuna alterazione morfologica e strutturale dei leucociti | Reazione negativa, l'alimento è tollerato |
| Presenza di leucociti con semplice rigonfiamento cellulare senza lesioni della membrana | Lieve positivo |
| Presenza di leucociti con vacuoli e leggere lesioni alla membrana cellulare | Positivo |
| Leucociti fortemente danneggiati, con evidenti variazioni di forma, membrana cellulare disgregata ed apertura cellulare | Forte positivo |